Nació en Italia en 1796. Su padre Gaetano fue traductor de Milton y de Horace Walpole, era poeta y, como su hijo, secretario de otro poeta célebre: Vittorio Alfieri. John creció en la colonia italiana del Soho. Estudió medicina en la universidad de Edimburgo y sé gradúa muy joven, a los 19 años. Su tema de disertación fue el sonambulismo y el mesmerismo.

En 1816 conoce a Lord Byron, de quien se hará secretario y médico, pero a la vez será el payaso de Lord Byron, la burla, consecuencia de ello escribirá en la velada del 18 de junio donde estará Mary Shelley, y de esa reunión John escribirá su obra inmortal El Vampiro inspirada en Byron y que se publicará en 1819. Éste es uno de los primeros libros en tratar el tema de los muertos vivientes o no muertos desde el punto de vista romántico, y esboza inmortalmente el que será la imagen clásica del vampiro literario, aquella del aristócrata vil, frío y enigmático, pero sobre todo perverso y fascinante ante las mujeres, inspirado en Byron.

La historia nos relata la vida de un noble inglés de nombre Ruthven que decide esparcirse un poco realizando un viaje alrededor de Europa acompañado por un joven llamado Aubrey, que no siente más que desagrado por la compañía del otro hombre. Cuando Ruthven es asesinado por asaltantes en uno de sus viajes, Aubrey vuelve a Inglaterra creyéndose libre por fin de tan odioso personaje, sin embargo, se encuentra con la noticia de que Ruthven no está muerto y va a casarse con la hermana del joven.

Aubrey se da cuenta de que éste es ahora un muerto viviente, o vampiro, pero se ve imposibilitado de hacer nada pues durante los viajes que hizo acompañando a Ruthven, le juró guardar el secreto de sus crímenes por un año y un día, por lo cual se debate el qué debe hacer.

Murió John William Polidori en agosto de 1821, medio loco, tras envenenarse a la edad de 25 años, sin disfrutar de la fama y escándalo de su libro maldito, quién en un principio fue achacado a Lord Byron.